转自：Abcam公众号

PD-1/PD-L1单克隆抗体药备受瞩目，是目前临床上研究和应用最广泛的免疫检查点抑制剂之一，阻断PD-1与PD-L1的结合，使T细胞恢复肿瘤杀伤活性，在多种肿瘤治疗过程中显示出卓越的疗效[1]。

目前FDA批准了2款PD-1抑制剂（Opdivo和Keytruda）和3款PD-L1抑制剂（Tecentriq、Imfinzi、Bavencio）上市。同时，也分别批准了相应的伴随/补充诊断抗体：28-8、22C3、SP142、SP263（克隆号，其中Bavencio无指定PD-L1诊断抗体）这4个PD-L1单抗，用于PD-L1表达水平的IHC检测[2]。就在上周6月15日，BMS的PD-1单抗药物纳武利尤（Opdivo, Nivolumab）的中国上市申请正式获得CFDA批准，用于二线治疗非小细胞肺癌。值得注意的是，这四个克隆号中有一半(28-8、SP142) 为abcam上市产品。

使用不同的诊断抗体，针对不同的肿瘤类型均有其独有的PD-L1打分机制。Opdivo在NSCLC的临床诊断中使用了PD-L1兔单抗28-8（ab205921, Abcam），它只统计肿瘤细胞膜染色（TC）的百分比。而对于SP142( ab228462, Abcam)，除了TC之外，也加入了对于肿瘤浸润的免疫细胞（IC）染色的评判，是唯一一个对肿瘤细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞均加以统计的检测抗体：评估基于PD-L1任何强度表达的肿瘤浸润性免疫细胞占肿瘤面积的比例（%IC）或PD-L1任何强度表达在肿瘤细胞中的比例（%TC）。然而这两种打分机制并无优劣之分。

PD-L1[28-8]的优势

如表1所示，PD-L1[28-8]作为PD抑制剂的补充诊断抗体，已经获得了FDA批准用于NSCLC和黑色素瘤患者的临床诊断[3]，具有特异性（经KO验证）、具有高灵敏性（兔单抗RabMab）、高重复性（重组抗体）等优点。

来自Abcam的质检数据

在生理或病理情况下human不同器官中的细胞定位（图1-a）；在KO的人肺腺癌细胞L2987 L2-14克隆中的流式验证（图1-b）；极低的批间差（图1-c， A为负参照，B-F为不同批次抗体）。

来自诊断平台的数据

国际肺癌研究协会（IASLC）牵头发起的 Blueprint 项目对上述 4 种 PD-L1 IHC 检测克隆进行了比较。结果显示，28-8、22C3 和 SP263 显示出相似的肿瘤细胞阳性染色百分比（图2-a）；而SP142 相对特殊，SP142染色阳性的肿瘤细胞较少,对肿瘤细胞的染色呈“点状”特性[4]，另一方面，SP142 相比于其他 3 种克隆对免疫细胞的染色更为突出（图2-b）[4]。

来自科研用户的数据

如图3所示：无论是IHC检测还是流式检测，PD-L1诊断抗体28-8与PD-L2并无交叉反应，呈现出高特异性[5]。

与竞争对手的PD-L1抗体相比，28-8与SP142拥有更高的特异性与灵敏度[3]。

如图4，Abcam[28-8] vs CST [E1L3N]，数据显示有些PD-L1诊断抗体并不特异[6]，作者分别使用PD-L1 28-8和 E1L3N 抗体，对野生型和敲除的人肺腺癌细胞系L2987和人卵巢透明细胞癌细胞系ES-2的石蜡切片进行了IHC染色：在其他条件保持一致的情况下，两种抗体（2 ug/mL）在L2987的KO细胞中均未检出信号（图7A-D）；28-8（3 ug/mL）在ES-2的KO细胞中未检测到信号，但E1L3N（2 ug/mL）却呈现了非特异的胞浆染色（图7E-H），这可能是因为识别了胞浆中的非PD-L1抗原[7]。

对20名NSCLC和20名黑色素瘤患者的TC和IC的IHC检测结果显示：相对于E1L3N，28-8是一个更优秀的伴随诊断抗体[3]。

PD-L1[SP142]的优势

Abcam已与Spring Bioscience签署了独家协议，由Abcam独家提供其经IHC应用优化的重组兔单抗SP克隆产品线。SP克隆是被开发专用于病理学和癌症研究的抗体。它们使用与Abcam现有 RabMAb® 兔单抗相同的技术，能确保高特异性，高灵敏度，及批次间的一致性。包括关于FDA批准的PD抑制剂Tecentriq的补充诊断抗体SP142(图5)，该抗体同时也被国内第一家申报上市的PD-1单抗（君实JS001）作为诊断抗体。与竞争对手的E1L3N相比，无论特异性还是灵敏度，SP142都更胜一筹[7]：当对Placenta染色时，SP142的工作浓度为0.44 μg/mL，而获得同级别染色强度的E1L3N为28 μg/mL；与此同时在使用E1L3N对Stomach和Nerve的IHC结果中出现了非特异的染色信号，而SP142并未出现此类结果[7]。

28-8 使用注意事项

手工操作

在使用28-8这一优异的抗体时，为了确保您获得出色的实验结果，请您务必配套使用如下试剂。

对于自动化免疫组仪平台和系统，推荐BioGenex i6000 with off-line HIER、 Leica BOND RX with on-line HIER、 Ventana Ultra with on-line HIER以及 Dako Omnis四种平台。
 

1）根据HE评估样本是否合适（如无肿瘤组织和形态以及是否坏死）；

2）水平质控是否合格（试剂对照和组织对照）；拍照时所有样本除了调整视野和焦距以外，显微镜其他部件一律不能动。

3）所有病例都必须采用配套增强试剂盒；

4）不合适的固定方法和时间会直接导致假阴性；

5）房间温度需控制在18～25℃，保持恒定的室温是染色成功的基本条件；

6）可靠的评估系统。

PD-L1  IHC 28-8 pharmDx打分规则：

如图6所示，PD-L1蛋白表达的定义是肿瘤细胞所呈现的任何强度的细胞膜阳性的百分率，细胞质染色（如果存在）不参与评分。根据阳性参照（可使用细胞石蜡切片）的染色结果将染色强度分为0（negative）、1+（weak intensity）、2+（moderate intensity）以及3+（strong intensity）；在至少两个染色强度条件下，至少80%细胞显示膜染色阳性，负参照背景强度小于1同时无膜着色信号。

不完整的肿瘤细胞膜染色pattern和完整的肿瘤细胞膜染色pattern均在打分范围内；

在整个样本中不仅膜染色，也出现细胞质阳性染色，应排除在打分之外；

免疫细胞染色，应排除在打分之外（图5）[5]。也可以参考表5中的一些建议尝试解决自动化检测平台中的常见问题。

除28-8外，Abcam还开发了针对PD-L1的兔单抗EPR19759(ab213524)，该抗体在IP和WB等应用中表现十分优异。

针对“one drug, one assay”模式，由FDA牵头，四家PD抑制剂研发企业和两家学术机构参与的“蓝图倡议”（Blueprint Initiative）正在试图找到其可能的一致性，希望在不久的将来，针对PD-L1 IHC的检测更加规范化。

参考文献

1. Chen, D.S. and I. Mellman, Elements of cancer immunity and thecancer-immune set point.Nature, 2017. 541(7637):p. 321-330.

2. Ancevski Hunter,K., M.A. Socinski,and L.C.Villaruz, PD-L1 Testing in Guiding Patient Selection for PD-1/PD-L1 Inhibitor Therapy in LungCancer. Mol Diagn Ther, 2018. 22(1):p. 1-10.

3. Cogswell, J., etal., An Analytical Comparison of Dako28-8 PharmDx Assay and an E1L3N Laboratory-Developed Test in theImmunohistochemical Detection of Programmed Death-Ligand 1. Mol Diagn Ther,2017. 21(1): p. 85-93.

4. Hirsch, F.R., etal., PD-L1 Immunohistochemistry Assaysfor Lung Cancer: Results from Phase 1 of the Blueprint PD-L1 IHC AssayComparison Project. J Thorac Oncol, 2017. 12(2): p. 208-222.

5. Phillips, T., etal., Development of an automated PD-L1immunohistochemistry (IHC) assay for non-small cell lung cancer. ApplImmunohistochem Mol Morphol, 2015. 23(8):p. 541-9.

6. Velcheti, V., etal., Programmed death ligand-1 expressionin non-small cell lung cancer. Lab. Invest., 2014. 94(1): p. 107-16.

7. Liao Z, Z.Y., CaiW, Zhang H, Alleman-Sposeto J, Smith S, et al., IHC performance of two rabbit anti-human PD-L1 monoclonal antibodies. Pleasanton: Spring Bioscience; 2014. https://products.springbio.com/products/PD-L1-CD274-SP142-/M442.

8. Ishida, Y., etal., Induced expression of PD-1, a novelmember of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death.EMBO J, 1992. 11(11): p. 3887-95.

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